POLQ能否成为继PARP后下一个合成致死的明星靶点？

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走向变革的合成致死赛道

合成致死（synthetic lethal）是肿瘤药物研发的热门领域之一，合成致死是指两个非致死基因同时被抑制，导致细胞死亡的现象。

这个概念最早可追溯到1922年，美国遗传学家卡尔文在果蝇的研究中发现，具有pd和 Pdr双基因突变的果蝇不能存活，而这其中任何一个基因单独突变都不会导致果蝇死亡。1946年，西奥多·多布赞斯基正式提出“合成致死”概念，用来描述这种不同基因之间的互补性致死作用（图1）。

在 2014 年，FDA 批准了首个获批的 PARP 抑制剂 —奥拉帕利，PARP 抑制剂是首款根据合成致死原理研发的抗癌药，目前全球已有6款PARP 抑制剂药物获批问世，2020年全球市场规模已超过31.35亿美元，根据Evaluate Pharma的预测，到2023年PARP抑制剂的销售额合计将达到45亿美元。在继PARP抑制剂上市后，“合成致死”作为肿瘤学疗法开发的新兴领域引起大家的热情。

未来合成致死领域研究重点一方面是固守PARP靶点，进行差异化设计，比如对PARP家族蛋白中的其他亚型进行药物开发抑或是通过下一代PARP抑制剂的开发克服耐药性问题，另一方面是利用新的技术筛选出合成致死疗法的潜在靶点，为新型合成致死疗法的药物开发打下基础。

随着科学技术的发展，以及细胞损伤修复机制研究的深入，研究发现除了PARP，还有其它一些靶点如ATR、ATM、WEE1、DNA-PK、BRCA、RAD51、MAT2A和POLQ等多种蛋白在DNA损伤修复中发挥重要作用（图2）。而这些靶点都有望成为合成致死药物研发的靶点。

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双链断裂修复与POLQ

双链断裂（DSB）在哺乳动物细胞中通过同源重组（HR），非同源末端连接进行修复（NHEJ），或仍然知之甚少的“替代”末端连接途径（a-EJ）。

人类DNA聚合酶θ（Polθ或POLQ）参与Theta介导的末端连接（TMEJ），也称为替代非同源末端连接（alt-NHEJ），或微同源介导的末端连接（MMEJ），其被视为双链碱基修复（DSBR）过程的备选修复。当同源重组修复缺陷（homologous recombination deficiency, HRD）时，同时抑制POLQ可以导致合成致死（图3）¹。

DSB修复的缺陷导致基因组不稳定和细胞死亡，最终导致生物体水平的癌症或发育疾病²。特别指出，基因缺陷对HR（例如 BRCA1/2）很重要，占遗传性乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌的大多数³。POLQ对于微同调介导的DNA双链断裂修复至关重要，已被提议作为治疗BRCA缺陷和其他DNA修复途径缺陷癌症的有吸引力的靶标。POLQ抑制剂与PARP抑制剂显示协同作用，POLQ抑制剂可能可以解决PARP抑制剂的耐药问题。

POLQ是一种易出错的易位聚合酶，也参与DNA双链断裂的修复，在癌症状态下经常被上调。POLQ 是一类大型的 DNA 聚合酶，包含一个N端类螺旋酶结构域、一个功能未知的中心结构域和C末端与DNA聚合酶A同源的聚合酶结构域（图4）⁴。

POLQ是癌症治疗中颇具前景的靶标，科学界和工业界也在积极开发POLQ抑制剂，2021年8月5日，Artios Pharma在clinicaltrials网站公示了First-in-class药物ART4215的临床登记信息，ART4215成为全球首个进入临床研究的，高选择性的口服小分子靶向Polθ聚合酶结构域POLQ抑制剂。

2022年8月10日，Artios Pharma宣布已启动了一项ART4215联合PARP抑制剂他拉唑帕利（talazoparib）治疗BRCA缺陷型乳腺癌的II期研究。ART4215在晚期实体瘤中的1期安全性和耐受性数据预计将于2023年上半年公布；BRCA缺陷乳腺癌的2期数据预计将于2024年公布⁵。

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POLQ抑制剂设计与优化

目前，对于POLQ的抑制主要从以下三个方面进行，包括ATP domain抑制剂、Polymerase domain抑制剂和POLQ的PROTACs（图5）。

根据之前文献报道，POLQ敲除引起的化学敏化效应特别是通过POLQ聚合酶活性的丧失⁶，因此，Martin等人的药物发现工作集中在发现聚合酶抑制剂而不是解旋酶抑制剂。

Martin等人开发了一种高通量DNA引物延伸实验测量全长（残基2−2590）POLQ的聚合酶活性⁷。使用该测定法，他们筛选了大约165,000 种化合物抑制 POLQ的能力，鉴定IC₅₀值在低微摩尔范围内的抑制剂。经过筛选他们发现苗头化合物1（图6A），它对POLQ的IC₅₀为4400 nM，且它在低摩尔浓度时在细胞MMEJ DNA修复纳米荧光素酶报告基因实验中具有活性（图6B）。

对苗头化合物1进行结构修饰，首先修饰了吡啶上取代基部分，主要目的是提供更有效的类似物。如图6A所示，R²对亲脂性取代基如三氟甲基（2）和异丙基（8）的修饰显著提高了活性，R¹处的进一步亲脂性取代基如溴（比较化合物4和1或者5和2）也显著提高了活性。

为了了解抑制的结构基础，将化合物5浸泡在三元配合物晶体中，并以3 Å分辨率（PDB：7ZX0）解析结构。化合物5结合在位于在与核苷酸结合位点相邻的手指亚域内（图7a）。该位点化合物5 Å内两侧是6个α螺旋，包括有18个主要疏水残基（图7b）。

此外，Tyr2420与5的丁腈基团形成氢键，将化合物锚定在结合位点。与三元复合物的结构（PDB：7ZUS）相比，蛋白质主链没有明显变化，而Y2412和Phe2416重新定向以适应5的结合（图7c）。开放（PDB：6XBU）和闭合构象（PDB：7ZX0）的比较表明，只有当手指采用闭合构象并且O-O1螺旋向内旋转时，变构口袋才存在（图7d）。从机制上讲，配体与变构位点的结合将酶锁定在封闭构象中并防止将其他核苷酸掺入到生长的DNA引物链中⁷。

根据上述晶体结构，Martin等人认为可以通过增加构象刚性稳定结合构象来调节活性。经过一系列不断地修饰优化，最终发现体内有效的探针化合物ART812（43）（图8和图9）。

Martin等人首先通过把醚连接链改成氮连接链、在中间连接链上引入甲基或者形成五元环得到一系列活性更好的化合物。接下来通过在五元环上引入羟基来降低LogD，而且分子对接也显示在五元环上引入羟基可以增加与Arg2419和Glu2365之间的盐桥作用，从而得到化合物ART558（图9）。

然而，化合物 ART558 不适合体内使用，因为它在小鼠微粒体中的清除率非常高，>1500 μL/min/mg。最后用吡啶内酰胺取代吡啶基脯氨酸，通过阻断2-位置氧化降低LogD并降低清除率，从而产生体内探针ART812（43）⁷。

化合物43在不同物种的体外清除率为低至中等，在人肝细胞中具有出色的稳定性。溶解度也很好，为880 μM。在体内，43显示出基于肝细胞稳定性的预测的2倍内的清除率（图10），在小鼠中观察到3 mg/kg的显着饱和度。在小鼠和大鼠中，43显示出良好的口服生物利用度和中度至高度暴露量⁷。

为了确定疗效所需的靶点参与和药物水平，Martin等人专注于DNA损伤的标志物，这些标志物可能是首先在非肿瘤动物中观察到。敲除小鼠的POLQ损失耐受性良好，但会导致微核诱导2-3倍（MN，由DSB或有丝分裂纺锤体功能紊乱引起的染色质核外片段），这表明监测这种现象可用于建立体内靶标调制。

MN在骨髓中形成，是存在于未成熟红细胞（网织红细胞，RET）和成熟红细胞（正色素性甲状腺细胞）中的唯一细胞核，使其成为方便检测的细胞类型。流式细胞术测定一组 4 天给药的最大耐受剂量为150 mg/kg BID的 43的 PK/PD结果显示网织红细胞中 MN 的诱导率为 2 倍（图11）⁷。

针对 POLQ的 HTS 筛选鉴定出低微摩尔抑制剂，通过限制抑制剂构象来优化效力。结合POLQ小分子抑制剂与蛋白的X射线晶体结构，表明POLQ抑制剂体外探针ART558通过稳定DNA结合酶的封闭构象阻断聚合酶活性。

通过将ART558的脯氨酸改性为内酰胺二醇和优化苯胺来降低LogD并提高代谢稳定性发现体内探针化合物ART812。ART812诱导小鼠微核的形成，并在BRCA-1 / SHLD-2缺陷异种移植模型中抑制肿瘤生长。

这些数据支持POLQ聚合酶抑制剂的进一步发展，以及最终临床探索单独或与PARP抑制剂和DNA损伤剂联合治疗遗传定义的癌症亚群。