下一代抗病毒药物：PROTAC策略的变革与挑战

病毒感染已成为公众健康和安全的严重关切，尤其是最近几年的SARS-COV-2病毒让人们更加重视这一领域。

目前，人类病毒感染的防治主要依靠药物和疫苗的结合。然而，不断增长的耐药菌株对目前可用的抗病毒治疗策略提出了挑战，而疫苗接种往往不能预防突变的或新型的病毒。因此，寻找基于靶向或疫苗接种这两种新型药物的前沿抗病毒治疗策略至关重要。

PROTAC相对于传统抗病毒药物有高特异性，高效性，使用催化剂量即可降解蛋白（不仅消除蛋白的催化功能，也消除蛋白的骨架功能）等优点，但是也有分子量大，细胞透膜性差和代谢不稳定等缺点。

目前还没有PROTACs被批准上市，本文主要总结PROTAC技术在抗病毒药物领域的研发进展。

病毒与PROTACs的发展

病毒在20世纪造成了大量死亡。例如，天花导致多达4亿人死亡，1918-1919年西班牙流感大爆发导致约1亿人死亡，人类免疫机能丧失病毒（艾滋病毒）流行病已造成3500万人死亡病例。截至2022年1月25日，COVID-19确诊病例已达到3.52亿例，其中560万人死亡。

病毒感染已成为公众健康和安全的严重关切。目前，人类病毒感染的防治主要依靠药物和疫苗的结合。然而，不断增长的耐药菌株对目前可用的抗病毒治疗策略提出了挑战，而疫苗接种往往不能预防突变的或新型的病毒。因此，寻找基于靶向或疫苗接种这两种新型药物的前沿抗病毒治疗策略至关重要。

PROTAC技术已被广泛研究用于POI的靶向蛋白质降解治疗疾病，它依赖于使用异型双功能分子将细胞内蛋白质降解机制募集到感兴趣的靶蛋白附近，使靶蛋白泛素化从而被降解（图1）^[1]。

图1. 基于PROTAC的降解的结构和机制

最近， PROTACs作为抗病毒疗法的作用方面取得了许多进展，探索了各种基于PROTAC的抗病毒治疗策略，这些策略具有改善的耐药性特征。

基于PROTAC的抗病毒策略

根据病毒的特点和进入宿主细胞繁殖过程，其中一些蛋白可以用作设计PROTACs的靶标蛋白，包括蛋白酶，表面受体蛋白，宿主蛋白，细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）等（图2）。下面详细介绍基于这些蛋白设计的PROTACs在抗病毒领域的应用。

图2. 靶向不同病毒靶标设计PROTACs

PROTAC病毒，一种新型疫苗策略

最近，Si等人描述了一种基于PROTAC的新型方法来生成用于疫苗接种目的的人工减毒流感病毒株。他们采用PROTAC技术通过宿主泛素-蛋白酶体系统对流感病毒的选定病毒蛋白进行靶向蛋白质降解，从而显着减弱病毒复制。

尽管PROTAC病毒在复制方面存在缺陷，但它们可以引发强大的免疫反应。为了产生减毒的流感PROTAC病毒，他们通过将蛋白酶体靶向结构域（PTD）连接到基质基因片段来设计甲型流感的基因组。

PTD是一种具有序列ALAPYIP的七肽，被VHL E3泛素连接酶识别。PTD对病毒蛋白的标记导致招募VHL E3连接酶进行多泛素化，然后由宿主泛素-蛋白酶体系统进行蛋白水解。

由于PTD肽通过烟草蚀刻病毒（TEV）切割位点接头肽（ENLYFQG）与病毒蛋白连接，它可以在稳定表达TEV蛋白酶的细胞系中有条件地裂解，从而避免PTD标记的靶蛋白的蛋白水解。因此，流感病毒在稳定表达TEV的细胞系中没有缺陷，产生减毒病毒用于疫苗生产的颗粒（图3）^[2]。

图3. a. PROTAC病毒的产生示意图；b. PTD的氨基酸和基因序列。蛋白酶体靶向肽以蓝色表示，TEVcs以橙色表示

Si等人测试了八种不同的甲型流感蛋白（M1，PB2，PB1，PA，NP，M2，NEP和NS1）用于PTD标记依赖性蛋白水解和MDCK2细胞的复制衰减和PTD切割效率以及保护表达TEV的MDCK2细胞（MDCK-TEVp）的蛋白水解。尽管PTD标记导致MDCK2细胞中八种蛋白质中的每一种都能有效地进行蛋白水解，但PTD切割效率以及MDCK-TEVp中对蛋白水解的保护是高度可变的。

这在很大程度上归因于PTD标记蛋白的TEV切割位点的可及性。在八种蛋白质中，M1（M1-PTD）的PTD标记显示MDCK2细胞中M1蛋白的有效蛋白水解，与野生型病毒相比，复制能力降低了>20,000倍。相反，M1-PTD病毒在表达MDCK-TEVp细胞系的TEV中有效复制。

他们还测试了M1-PTD诱导小鼠和雪貂免疫反应的能力，并检测了HI（血凝素抑制），NT（中和）、HA（血凝素）和内部保守的核蛋白抗体明显高于接种灭活流感疫苗（IIV）或冷适应型流感疫苗（CAIV）的疫苗。强大而熟练的T细胞免疫反应也由于MHC分子对降解病毒肽抗原的增强呈递而被检测到（图4）。

图4. 评估PROTAC病毒M1-PTD在小鼠和雪貂中的免疫原性

PROTAC病毒具有作为理想候选疫苗的潜力。理想的疫苗是能够在宿主中达到足够的衰减水平以确保安全性，同时在细胞系中保持强大的免疫原性。与传统方法相比在疫苗生产中，PROTAC利用降解的病毒肽产生蛋白酶体降解途径触发有效的免疫应答。

PROTAC技术比其他衰减方法更有效，因为改进了安全性以及功效或生产力的累积损失。传统基于衰减的方法面临的另一个突出挑战是由于快速病毒进化而导致的免疫逃逸。因此，PROTAC技术已成为生产更安全、更有效的疫苗的重要选择。

靶向蛋白酶的PROTAC

病毒编码一种或多种蛋白酶，作为支持压缩基因组复制的典型技术。为了产生成熟的病毒蛋白，病毒基因组用整合的病毒蛋白酶编码多蛋白，该蛋白酶在几个特定位置切割多蛋白。由于它们对繁殖的必要性，病毒蛋白酶是极好的治疗靶标。

病毒生命周期和复制取决于病毒蛋白酶。来自不同病毒家族的蛋白酶在结构、催化机制和优选底物方面彼此不同。病毒蛋白酶具有特定的底物偏好可用于设计抑制剂以产生强效和选择性的类药化合物。

关于病毒蛋白酶作用的广泛研究暗示了它们在病毒复制阶段的重要性作用。因此，病毒蛋白酶是抗病毒策略中抑制病毒复制的常见靶标。在过去的几十年里，已经开发了针对病毒蛋白酶的各种小分子抑制剂。为了克服耐药性并提高抗蛋白酶小分子抑制剂的疗效，一些研究人员应用了基于PROTAC的靶蛋白降解病毒蛋白酶。

Yang等人报道了针对丙型肝炎病毒（HCV）非结构性3/4A（NS3/4A）丝氨酸蛋白酶的PROTAC化合物。特拉匹韦，一种可逆共价抑制剂，与HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的活性位点结合，用于开发用于该蛋白酶的PROTAC降解剂（图5）。

特拉匹韦的晶体结构与病毒蛋白酶显示，其吡嗪环是溶剂暴露的，允许它与CRBN配体通过连接链偶联。所得的基于特拉匹韦的降解剂DGY08-097对HCV NS3/4A蛋白酶选择性抑制和降解^[3]。

图5. 特拉匹韦和PROTACs的结构

靶向表面受体的PROTAC

病毒包膜是包裹衣壳的脂质双层。它嵌入了许多糖蛋白到其表面，使病毒能够附着在宿主细胞的受体上。另一方面，除了包膜中存在的这些糖蛋白外，许多冠状病毒（CoV）还具有维持病毒复制所必需的独特包膜和膜蛋白。病毒表面蛋白，如血凝素和神经氨酸酶，正在成为抗病毒治疗的新靶标，由于它们与宿主细胞表面的受体明显不同。

血凝素是一种凝集素，通过识别细胞表面存在的末端唾液酸残基使病毒附着在细胞表面的受体^[4]。神经氨酸酶通过切割病毒包膜上存在的血凝素与宿主细胞膜上的唾液酸残基之间的键，帮助将病毒从一个唾液酸残基转移到另一个唾液酸残基。

病毒穿过宿主的细胞膜，直到它识别并附着在适当的细胞受体上，使其进入宿主细胞。同样，神经氨酸酶的活性也使新产生的病毒粒子有可能离开宿主细胞的表面。病毒包膜的任何损坏都可能由于产生还原的氧气而不可逆转地损坏它，因为病毒缺乏修复它们的机制。

Zhou等人报告了基于奥司他韦骨架的新型PROTAC分子的设计和合成，以对抗严重的年度流感爆发（图6）^[5]。奥司他韦是一种神经氨酸酶抑制剂，可防止宿主细胞新合成的病毒颗粒出来。基于奥司他韦的PROTACs通过泛素-蛋白酶体途径降解神经氨酸酶。

图6. 奥司他韦以及PROTACs的结构

靶向宿主蛋白的PROTAC

宿主细胞感染病毒后，病毒劫持宿主细胞合成病毒蛋白和核酸以进行快速繁殖和组装的机器。几种酶是病毒复制和生产力所必需的。这些包括参与各种核酸交易的聚合酶、核酸内切酶和连接酶。

抗病毒疗法发展的新转变已经出现在寻找宿主蛋白作为靶标方面。它将能够解决病毒耐药性的死灰复燃问题。此外，由于病毒病原体需要宿主机器来复制其遗传物质，因此成功靶向宿主蛋白将有助于绕过频繁调整经常使用抗病毒药物的障碍，以有效靶向快速突变的病毒基因组。

吲哚美辛（INM）是一种非类固醇抗炎药，具有镇痛和解热特性，已知可抑制PGES-2（前列腺素E合酶-2型），这是一种已知参与类花生酸酶的生物合成。

Goracci等人报道INM通过脂肪族或聚乙二醇连接链与VHL E3连接酶配体偶联合成的PROTACs^[6]。由于这些PROTACs靶向宿主蛋白PGES-2，因此它们有很明显的抗病毒活性（图7）。

图7. 吲哚美辛和PROTAC化合物对SARS-CoV-2的抗病毒活性和细胞毒性

同样，众所周知，细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）在DNA和RNA病毒的生命周期中发挥重要作用。CDK1、CDK2、CDK3、CDK4/6、CDK5、CDK7和CDK9抑制剂始终对多种病毒（包括HSV、HIV、人巨细胞病毒和SARS-CoV-2）显示出有效的抗病毒活性。

Hahn等人报道了CDK9的PROTAC THAL-SNS032（图8）。该PROTAC是通过将E3连接酶CRBN招募到CDK酶附近，使其泛素化，然后降解。THAL-SNS032主要导致CDK9降解，但也导致CDK1、2和7降解^[7]。此外，THAL-SNS032还靶向HCMV编码的CDK直系同源物pUL97，其在病毒中起重要作用（图8）。

图8. CDK9的PROTAC THAL-SNS032的结构与抗病毒活性

PROTACs抗病毒策略优劣

PROTACs由于其特异性，高效性，催化量等作用机制相对于传统抗病毒药物有很大的优势，具体见表1。

表1. PROTACs相对于传统抗病毒药物的优势

尽管PROTACs比其他小分子抑制剂更强大，并且完全耗尽细胞中所需的靶蛋白，但它们可能会在宿主细胞中引起靶向毒性，并可能损害正常的细胞功能。PROTAC靶向的一些POI可以同时具有酶促功能以及其他支架功能，这些功能可能对正常细胞功能很重要。因此，它们的完全消除可能对细胞有毒。

PROTAC对目标蛋白的降解也可能降解与靶蛋白直接或间接相关的蛋白质，导致脱靶效应。如果PROTAC与新底物结合，脱靶效应也会引起新形态相互作用，因此，未来的研究应侧重能够进一步降低PROTACs脱靶毒性。

— 小结 —

PROTAC技术有望在未来开发有前途的和潜在的下一代抗病毒药物。PROTAC技术对一系列致病蛋白具有扩展的功能，并且可以有效对抗通过突变和适应病毒获得的耐药性。

除了现有的已知连接酶集合外，还可以通过探索更多的E3连接酶来进一步扩展该技术，因为E3连接酶机制核心的基因组改变已经加剧了对基于PROTAC的治疗的耐药性。

PROTAC技术的也有一些缺点包括分子量大，细胞通透性差和代谢不稳定。CLIPTAC（CLIck形成的蛋白水解靶向嵌合体）技术已被用于尝试解决这个问题^[8]。在点击化学中，双功能分子分为两部分：靶蛋白的配体和与连接酶结合的另一部分。

这些部件通过在细胞中的快速反应组装形成PROTAC分子。由于这两部分都具有低分子量和改善的细胞通透性，因此它们显着改进了该技术。连接链也会显著影响PROTAC化合物的活性、选择性和成药性。

目前已经有很多不同的PROTACs进入临床研究，其中进展最快的是Arvinas的ARV-110和ARV-471，任何一门新的技术的成功都离不开无数人的努力，未来期待PROTAC能在抗病毒领域有更大的应用和发展。

参考文献：（上下滑动查看更多）

1. Haleema Ahmad , Bushra Zia , Hashir Husain and Afzal Husain, Recent Advances in PROTAC-Based Antiviral Strategies, Vaccines 2023, 11, 270.

2. Si, L.; Shen, Q.; Li, J.; Chen, L.; Shen, J.; Xiao, X.; Bai, H.; Feng, T.; Ye, A.Y.; Le Li, L.; et al. Generation of a live attenuated influenza A vaccine by proteolysis targeting. Nat. Biotechnol. 2022, 40, 1370–1377.

3. De Wispelaere, M.; Du, G.; Donovan, K.A.; Zhang, T.; Eleuteri, N.A.; Yuan, J.C.; Kalabathula, J.; Nowak, R.P.; Fischer, E.S.; Gray, N.S.; et al. Small molecule degraders of the hepatitis C virus protease reduce susceptibility to resistance mutations. Nat. Commun. 2019, 10, 3468

4. Suzuki, Y. Sialobiology of Influenza: Molecular Mechanism of Host Range Variation of Influenza Viruses. Biol. Pharm. Bull. 2005, 28, 399–408.

5. Xu, Z.; Liu, X.; Ma, X.; Zou, W.; Chen, Q.; Chen, F.; Deng, X.; Liang, J.; Dong, C.; Lan, K.; et al. Discovery of oseltamivir-based novel PROTACs as degraders targeting neuraminidase to combat H1N1 influenza virus. Cell Insight 2022, 1, 100030.

6. Desantis, J.; Mercorelli, B.; Celegato, M.; Croci, F.; Bazzacco, A.; Baroni, M.; Siragusa, L.; Cruciani, G.; Loregian, A.; Goracci, L. Indomethacin-based PROTACs as pan-coronavirus antiviral agents. Eur. J. Med. Chem. 2021, 226, 113814.

7. Hahn, F.; Hamilton, S.T.; Wangen, C.; Wild, M.; Kicuntod, J.; Brückner, N.; Follett, J.E.L.; Herrmann, L.; Kheimar, A.; Kaufer, B.B.; et al. Development of a PROTAC-Based Targeting Strategy Provides a Mechanistically Unique Mode of Anti-Cytomegalovirus Activity. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 12858.

8. Lebraud, H.; Wright, D.J.; Johnson, C.N.; Heightman, T.D. Protein Degradation by In-Cell Self-Assembly of Proteolysis Targeting Chimeras. ACS Cent. Sci. 2016, 2, 927–934

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